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技術文章

流式細胞儀

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細胞凋亡的檢測方法眾多,流式細胞儀檢測凋亡,是常用的方法。由于流式細胞儀固有的特點――可以準確的進行凋亡細胞的計數。因此,具有其它方法*的*性。本文主要結合我室的一些實際經驗,力圖簡單明了的介紹流式在檢測凋亡方面的應用。

下面是一幅凋亡過程圖。在凋亡誘導劑的作用下,首先是細胞色素C和apa f-1形成復合體,線粒體的功能發生衰退;后是caspase家族激活,磷脂酰絲氨酸外翻,這時細胞的形態已經發生了改變,可以看到細胞變小,胞核皺縮;后是細胞內DNA斷裂,形成凋亡小體。

在凋亡發生的各個過程當中,都有相應的流式細胞儀的檢測方法,我室曾經檢測過的方法包括:

1:線粒體功能

2:DNA Cycle

3:Caspases  

4:Annexin V Assay

6:DNA Fragmentation Assays

基本上涵蓋了細胞凋亡的各個期,對各種檢測方法的原理和特點做一個簡單介紹。

線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達科為公司代理的試劑盒(產品編號為BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是:正常細胞中,染料可以在線粒體內聚集,發出明亮的紅色熒光;而細胞凋亡后,其線粒體膜電位發生改變,染料無法進入線粒體,只能在胞質中以單體形式存在,發出綠色的熒光??梢栽跓晒怙@微鏡下,或流式檢測。采用488nm激發,其檢測波長分別是527nm和590nm。整個實驗過程操作簡單,只需要30min就可以見到結果。

Caspase家族可以檢測的分子非常多,也有不少商業的試劑盒可以應用。即使沒有相應的試劑盒,只要有相應抗體基本上是可以檢測的,具體的方法是參照細胞內蛋白檢測的步驟。

在細胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態特征改變,細胞膜的改變是這些特征中較早出現的一種。在凋亡細胞中,細胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外側。Annexin-V是一種35-36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結合蛋白,它對PS具有較高的親和力。細胞凋亡時,可以和外翻的PS結合,從而可以檢測凋亡的細胞。發生死亡的細胞其細胞膜上的PS也外翻,因而也會陽性。因此,常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標記之外,還會加一種DNA染料,常用的有PI和7-AAD,由于死亡的細胞膜通透性增高,染料可以進入細胞內和DNA結合,從而可以發熒光,區分出死細胞。

下圖給出的是在使用FAS單抗誘導前后的檢測結果,橫坐標是Annexin-V FITC, 縱坐標是PI,左上、右上、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細胞,左下象限是存活的細胞,右下象限是凋亡的細胞。

在采用Annixin V方法檢測凋亡細胞時,要特別強調一點:該方法適用于懸浮生長的細胞,如:淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞,由于在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷,會造成較高的假陽性,從而影響檢測結果。盡管目前,包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差,且需要操作時非常小心。

DNA周期檢測原本是用來反應細胞各個期,即細胞增殖狀況的。利用細胞內DNA能夠和熒光染料,如PI,結合的特性。細胞各個期由于其DNA含量不同從而結合的熒光染料不同,流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩倍,而S期介與兩者之間。

但是由于發現凋亡的細胞DNA含量較少,因而可以在細胞G0-G1期前面有一個亞二倍體峰,從而認為是凋亡細胞。但是由于死亡的細胞本身其DNA含量也是減少的,因而非常難于區分凋亡和死亡的細胞。在90年代,該方法曾經風靡一時,現在看來,那時的實驗結果需要推敲。盡管,經典的流式檢測資料給出的圖是認為凋亡的細胞是緊挨著G0-G1期峰的一個峰,死亡的細胞峰離G0-G1期峰較遠,但是這種典型的結果似乎很難獲得。有其它的替代方法,*可以不用這種方法。

下圖橫軸代表PI的熒光強度,縱軸代表細胞數目,各個期根據熒光強度可以簡單的進行區分。

晚期凋亡的細胞由于DNA的斷裂,因而可以出現DNA ladder,從而也就有了經典的檢測方法TUNEl。流式也能也能進行Tunel檢測,其檢測原理與經典Tunel原理基本一致。以BD公司的為例,其利用TdT能將熒光素標記的dUTP標記到斷裂的DNA末端,從而使凋亡的細胞具有熒光。但是由于在細胞內標記,細胞需要進行固定處理,操作類似免疫組織化學法,容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒,并且嚴格的設立對照。經過預實驗方法穩定后再進行大規模實驗。標本處理后,均可以用熒光纖維鏡進行觀察,拍照。流式檢測后,可以進行的計算凋亡百分比。這一點,經典TUNEl是做不到的。

TEL:18016231680

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